【癌症基因】- HPV基因分型筛查（女）

　　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。每年，全球有将近50万女性被诊断为宫颈癌，其中有半数患者发生在亚洲。在我国，宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中占第二位，仅次于乳腺癌，每年新发宫颈癌病例数约占世界总发病数的28%。

　　宫颈癌早期症状隐匿，即使宫颈上皮内瘤变(CIN)已发展为早期宫颈癌，仍然有半数以上患者没有临床症状。因此，凭肉眼观察无法诊断宫颈上皮内瘤变和宫颈癌。而一旦疾病发展成癌症并扩散至其他器官，每5名女性患者中只有1人能存活5年。尽早筛查，及时发现和治疗宫颈癌前病变是防治宫颈癌、降低疾病死亡风险的重要手段。

　　在全球，宫颈癌筛查开展了近50年，已大大减少了宫颈癌发病与死亡率，但宫颈癌筛查仍面临着费用高、医疗资源不足、以及人群覆盖率低与随访率低的三大“瓶颈”问题。因此，宫颈癌筛查迫切需要兼具高敏感、高通量且易于大规模实施的筛查方案。“高风险HPV分型联合细胞学检测”的宫颈癌筛查模式不仅能保持HPV筛查高敏感性的优势，有效提高特异性，还大大减少需细胞学检查与阴道镜回叫率，更为经济。同时，以PCR技术为基础的HPV分型检测敏感性更高，检测通量高，重复性更好，并且一次检测同时完成一次筛查(HPV初筛)与二次筛查(筛查阳性者高风险亚型的分流)，适用于大样本人群宫颈癌筛查以及宫颈癌病变临床诊治。这一筛查模式也得到了2013年亚太区生殖道感染与肿瘤研究组织(AOGIN)年会各国女性健康专家的认可。

　　筛查是关键，技术手段待突破

　　目前宫颈癌初筛的常用手段是细胞学涂片，主要检查宫颈细胞的变异情况。自1941 年传统巴氏涂片被引入临床作为常规筛查项目以来，一些国家的宫颈癌发病及死亡率已大幅下降。但巴氏涂片准确性受多种因素影响，如：涂片取材方法、涂片制作、染色技巧、读片水平等，临床应用中假阴性率及误诊率较高，而且对患病的风险性无法进行预测。

　　近年来，液基薄层细胞学检测技术、细胞学自动阅片系统和细胞学形态学描述分类(TBS)的应用有效提高了细胞学检测的诊断价值，但仍然存在受人为因素影响较大及灵敏度低的问题，且这些新技术在提高筛查效果的同时也增加了单张涂片成本，在大规模筛查应用上受到限制。

　　高风险HPV基因检测：宫颈癌筛查新方向

　　以往，宫颈癌筛查是以早期检出宫颈癌为目的，而随着宫颈癌病因及病程的明确，现代宫颈癌筛查已将早期检出高级别CIN 并进行阻断性治疗作为目标。

　　近年来，人类乳头状瘤病毒(HPV)的发现及分型为宫颈癌筛查提供了一个全新途径。1976 年，Zur Hausen H 首次提出人类乳头状瘤病毒(HPV)与宫颈癌的发病密切相关。随后大量流行病学资料及研究已明确显示HPV 持续感染是宫颈癌发病的首要条件。绝大多数宫颈癌样本都可检出HPV，HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌，但并非所有HPV 感染者都会进展为癌。大部分HPV感染仅为一过性感染，只有HPV持续感染才可能发展为CIN和癌症。此外，不同亚型的致病性及疾病预后存在差异。研究显示，有14种HPV病毒株(HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66和68b)是造成宫颈癌及其癌前病变的高风险HPV亚型，其中HPV16和HPV18这两种病毒株的风险最高，可导致70%-85%的宫颈癌病例，且感染后病毒清除率较低，治疗后病灶残留率和复发率较高。

　　宫颈癌发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期，如能及时进行HPV检测，并在癌前病变阶段进行医学干预，其治愈率可达98%。同时，由于不同HPV亚型的致病性及预后的差异，如能对HPV进行分型，将有助于有效识别高危人群。由于宫颈HPV 感染多为隐性亚临床感染,，且HPV 不能在培养环境中稳定生长，因此，HPV感染只能通过HPV基因检测或基因表达的检测来发现。

　　近年来，高风险HPV基因检测以其高灵敏度、快速、客观的特点，联合传统、经济的细胞学检测，成为宫颈癌筛查的最佳方案，并得到美国预防服务工作组(USPSTF)发布的2012年新版宫颈癌筛查指南、美国癌症学会(ACS)、美国阴道镜检查与宫颈病理学会(ASCCP)和美国临床病理学会(ASCP)联合发布的2012年新版宫颈癌筛查指南的推荐。目前，亚太区各国专家正根据当地情况研究美国相关指南，从而改善现行宫颈癌筛查制度，希望进一步帮助降低国内宫颈癌的发病率和死亡率。

　　HPV基因检测联合细胞学方法：宫颈癌筛查和临床诊治的新动力

　　和其他宫颈癌筛查方法相比，HPV基因检测受人为因素影响小，灵敏度高，用于人群筛查漏诊率小于5%，阴性预测值高达99%，且可预测患病风险，并可对被筛查者自助获取的宫颈阴道脱落细胞样本进行检测，但其特异性相对较低，阳性者多为一过性HPV感染而非癌前病变，导致阴道镜回叫率和宫颈活检的比例增加，从而增加了患者的精神压力及随诊费用。因此，有必要探讨二次筛查指标，对筛查阳性者进一步分流。对30岁以上的女性采用HPV检测作为初筛，以HPV高风险亚型(16、18)联合细胞学为二次筛查，是目前评价较好的筛查方案。

　　可分型的HPV为初筛联合细胞学“序贯二次筛查”的方案见下图。若HPV初筛为阴性，则筛查结束，每2-3年进行复查即可;若HPV 16或18亚型阳性，则需要接受阴道镜下宫颈活检;若HPV 16或18以外的HPV亚型呈阳性，则要联合细胞学进一步检查。若细胞学检测结果为未明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)及以上级别病变，则需要接受阴道镜下宫颈活检;若细胞学检测结果为阴性，则每年采用HPV基因检测联合细胞学方法进行复查即可。该方法同时完成HPV初筛与高风险亚型的二次筛查，可在保持HPV筛查高敏感性、高阴性预测值、高检测效率优势的前提下，有效提高特异性，大大减少需细胞学检查与阴道镜回叫率，在宫颈癌大样本人群筛查中具有显著优势。通过有效利用HPV基因分型检测技术，可有效地分流HPV阳性的高风险人群，并可预测受检者患宫颈癌的风险，确定最合适的筛查间隔。

　　HPV高风险亚型(16、18)有提示病变的作用，在临床诊治中同样具有重要作用。对于细胞学阴性者，如果接受高风险HPV基因检测，就有可能发现细胞学漏诊的宫颈病变患者;对于细胞学检测结果为ASCUS者， HPV基因检测可有效的再分类，进一步发现近期宫颈癌高风险者并进行严密随访;对于细胞学检测结果与宫颈病理诊断均为低度病变的高风险者，HPV基因检测更成为有效的随访指标。

　　cobas 4800 HPV dna检测：可分型的高灵敏HPV基因检测

　　目前临床常用的HPV 基因检测方法主要基于聚合酶链反应(PCR)或核酸杂交技术。第二代核酸杂交捕获法，可同时检测13种高危HPV，得到了较广泛的应用，但其无法对HPV进行基因分型鉴定，尤其无法鉴别HPV16和HPV18这两种患病风险最高的亚型。传统的PCR检测方法虽然具备高敏感性，但容易产生样品交叉污染导致的假阳性，且进行基因分型时操作繁琐。而新一代以PCR为基础的HPV DNA分型检测(例如cobas 4800 HPV dna检测)灵敏度高，能够同时完成高风险HPV检测与DNA基因亚型筛查，是目前进行HPV基因检测的较好方法，且其检测高通量、重复性好，在大样本筛查中具有独特优势。

　　cobas 4800HPV dna检测采用全自动样品制备与实时聚合酶链反应(PCR)扩增和检测技术，集全自动样品制备、PCR扩增、基因分型检测于一体，提供HPV16型、18型和其他12个高风险HPV亚型(HPV31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66和68b)汇总的结果。除检测HPV病毒之外，也检测β-球蛋白，作为内部质控并确定样本是否含有抑制扩增的因素。其样本制备由x 480全自动样品制备仪自动完成，采用的磁珠分离技术具有高效、易于实现自动化的特点，并可消除潜在的PCR抑制。PCR扩增则采用z 480全自动实时聚合酶链反应(PCR)扩增仪。为保证PCR结果的准确性，预防非特异性PCR扩增和污染，z480的反应体系中加入了AmpErase酶进行选择性扩增，且工作环境密闭，不需进行常规PCR实验室的分区操作，避免了人为污染。该检测已获得美国FDA、欧盟CE认证，并于2012年获得中国SFDA批准，在宫颈癌筛查及诊疗领域将拥有广阔的应用前景。

　　结论

　　1. HPV为初筛方案因其高敏感性，高阴性预测值、高检测效率而适于大样本人群筛查

　　2. HPV高致病亚型(16,18)有提示病变作用，是有效的二次筛查指标

　　3. HPV高致病亚型(16,18)联合细胞学“序贯二次筛查”可在保持HPV筛查高敏感性优势的前提下，有效提高特异性，并且大大减少需细胞学检查与回叫率，更符合卫生经济学要求

　　4. 以PCR为基础的HPV分型检测用于自取样本的检测同样具有高敏感性，由于同时完成了HPV初筛(一次筛查)与HPV DNA亚型的二次筛查，及检测的高通量和重复性好，在大样本筛查中具有独特优势